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近日，蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院/江蘇省血液研究所唐雅瓊博士等為第一作者、吳德沛教授和韓悅教授為共同通訊作者在《Science Advances》（Sci Adv）雜志發(fā)表題為《Hypermethylation of DNA impairs megakaryogenesis in delayed platelet recovery after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation》的研究論文。研究聚焦于造血干細胞移植（Hematopoietic Stem Cell Transplantation，HSCT）后延遲血小板恢復(fù)（Delayed Platelet Recovery，DPR）這一復(fù)雜并發(fā)癥，揭示了在DPR患者體內(nèi)，造血干細胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）和巨核細胞祖細胞（Megakaryocyte Progenitor Cells，MKPs）的CG島區(qū)域存在顯著高甲基化。經(jīng)低甲基化藥物地西他濱（Decitabine）干預(yù)后，可以降低MKPs中甲基化CG水平，并在小鼠模型中增強巨核細胞生成。研究還揭示DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A在巨核細胞系中對巨核細胞生成的負向調(diào)控作用，DNMT3A能夠直接結(jié)合并甲基化ETS1和RUNX1基因，從而影響巨核細胞生成過程。易基因科技為本研究提供多組學(xué)技術(shù)（包括WGBS、ChIP-seq、RNA-seq測序和分析）服務(wù)。

標題：Hypermethylation of DNA impairs megakaryogenesis in delayed platelet recovery after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation（DNA高甲基化影響異基因造血干細胞移植后延遲血小板恢復(fù)中的巨核細胞生成）

發(fā)表時間：2025-05-07

發(fā)表期刊：Science Advances

影響因子：IF12.5/Q1

易基因提供技術(shù)：WGBS、ChIP-seq、RNA-seq

DOI：10.1126/sciadv.ads3630

 

易小結(jié)

造血干細胞移植（HSCT）后延遲血小板恢復(fù)（DPR）是一種常見且預(yù)后不良的復(fù)雜并發(fā)癥，其機制尚未完全闡明。

本研究成功展示了多組學(xué)整合分析技術(shù)（WGBS、ChIP-seq、RNA-seq）在深入解析此類復(fù)雜臨床問題中的強大效力。通過協(xié)同應(yīng)用這些技術(shù)，我們得以跨越單一維度的局限，系統(tǒng)性地揭示DPR患者關(guān)鍵造血細胞群體中表觀基因組與轉(zhuǎn)錄組的異常特征及其內(nèi)在聯(lián)系，從而精準定位核心調(diào)控因子及其作用網(wǎng)絡(luò)。這充分體現(xiàn)了多組學(xué)技術(shù)在破譯疾病分子機制、發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點方面的獨特優(yōu)勢。

這些發(fā)現(xiàn)不僅為理解DPR提供了新視角，更重要的是，有力地提示了多組學(xué)整合策略在未來類似臨床研究中的普適性價值。該策略有望成為深入探索復(fù)雜疾病機制、加速精準診斷標志物發(fā)現(xiàn)、以及指導(dǎo)靶向治療策略（如基于表觀遺傳調(diào)控的干預(yù)）開發(fā)的關(guān)鍵路徑。本研究為運用系統(tǒng)性多組學(xué)方法攻克臨床疑難問題提供了可借鑒的范例。

 

研究意義

?   為DPR這一臨床常見且預(yù)后不良的并發(fā)癥提供了新的發(fā)病機制解釋，即異常DNA甲基化在其中發(fā)揮重要作用，填補了該領(lǐng)域在表觀遺傳學(xué)層面研究的空白。

?   基于對DNA甲基化調(diào)控機制的深入理解，為開發(fā)靶向DPR的新型治療策略，如利用低甲基化藥物地西他濱等，提供了有力的理論依據(jù)，有望改善DPR患者的臨床預(yù)后。

?   進一步拓展了對造血干細胞分化過程中表觀遺傳調(diào)控的認識，尤其是巨核細胞生成這一特定細胞系的表觀遺傳學(xué)特征，有助于完善造血干細胞分化調(diào)控的理論體系。

 

研究方法

?   樣本收集與處理：收集接受異基因HSCT后出現(xiàn)DPR的患者骨髓樣本，同時在患者造血功能恢復(fù)良好（Good Graft Function，GGF）時再次收集骨髓樣本作為對照。

?   細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化：體外巨核細胞培養(yǎng)，純化和分離 HSC、MKP 和巨核細胞。

?   全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）：從DPR患者和GGF患者的骨髓中分離HSCs和MKPs進行WGBS測序，分析全基因組范圍內(nèi)CG和非CG（CHG和CHH）位點的甲基化修飾情況，以揭示DPR狀態(tài)下HSCs和MKPs的DNA甲基化特征。

?   染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）：利用抗DNMT3A特異性抗體對HSCs進行染色質(zhì)免疫沉淀測序，確定DNMT3A在基因組上的結(jié)合位點，探究其在巨核細胞生成過程中對基因表達的調(diào)控作用。

?   RNA測序（RNA-Seq）：分析不同處理條件下細胞的轉(zhuǎn)錄組變化，結(jié)合DNA甲基化數(shù)據(jù)，探究甲基化修飾對基因表達的影響。

?   動物實驗：采用C57BL/6小鼠模型，通過腹腔注射地西他濱或?qū)φ杖軇?span>DMSO，觀察小鼠血小板計數(shù)、巨核細胞多倍體化等指標的變化，評估地西他濱對巨核細胞生成和血小板恢復(fù)的促進作用。構(gòu)建過表達DNMT3A的HSCs移植模型，研究DNMT3A對小鼠移植后血小板恢復(fù)的影響。

?   基因編輯與功能驗證：利用慢病毒介導(dǎo)的基因過表達和敲低技術(shù)，對CD34+細胞進行DNMT3A基因的編輯，然后在體外培養(yǎng)條件下檢測巨核細胞生成情況，包括細胞增殖、分化以及集落形成能力等指標，驗證DNMT3A在巨核細胞生成中的功能。

?   臨床樣本驗證：檢測DPR患者和GGF患者骨髓中CD34⁺ CD41⁺細胞內(nèi)ETS1和RUNX1基因的表達水平，驗證DNMT3A調(diào)控的靶基因在DPR發(fā)病過程中的表達差異。

 

結(jié)果圖形

（1）DPR患者移植后HSCs和MKPs的DNA高甲基化特征

通過WGBS研究結(jié)果表明，與GGF患者相比，DPR患者HSCs和MKPs中CG位點的甲基化水平顯著升高，表現(xiàn)為CG島區(qū)域的高甲基化。在染色體分布上，DPR患者HSCs和MKPs的各染色體上均呈現(xiàn)出相對高甲基化狀態(tài)，且HSCs相比MKPs存在更多的高甲基化區(qū)域，但在DPR患者中，巨核細胞調(diào)控基因在HSCs和MKPs之間的甲基化差異并不明顯。

圖1：DPR患者移植后HSCs和MKPs的DNA高甲基化情況。

（A）每個樣本的甲基化CG。左側(cè)為所有基因；右側(cè)為巨核細胞調(diào)節(jié)基因。GH1–3表示三例患者處于良好移植功能（GGF）時的HSCs；DH1–3表示三例患者處于DPR時的HSCs；GM1–3指三例患者處于GGF時的MKPs；DM1–3指三例患者處于DPR時的MKPs。

（B）DPR和GGF患者HSCs和MKPs中CG島的平均甲基化率。

（C）DMRs的染色體分布。X軸表示23對染色體和線粒體染色體；Y軸表示每條染色體的低甲基化和高甲基化DMRs的數(shù)量。左側(cè)為GGFH vs PTH；右側(cè)為GGFM vs PTM。GGFH為處于GGF的患者HSCs；PTH為處于DPR的患者HSCs；GGFM為處于GGF的患者MKPs；PTM為處于DPR的患者MKPs。

 

（2）低甲基化藥物地西他濱促進巨核細胞增殖和分化，伴隨巨核細胞生成過程中的全基因組DNA去甲基化和轉(zhuǎn)錄組變化

C57BL/6小鼠經(jīng)地西他濱干預(yù)后，小鼠血小板計數(shù)顯著增加，巨核細胞多倍體化水平提高，表明巨核細胞成熟度改善，而MKPs數(shù)量未見明顯差異。體外實驗中，地西他濱干預(yù)的Meg01細胞中CD41+細胞比例增加。WGBS結(jié)果顯示，地西他濱干預(yù)小鼠的巨核細胞和MKPs中mCG水平降低，而mCH水平在兩組間相似，表明地西他濱主要作用于5mC甲基化。主成分分析顯示，地西他濱干預(yù)組與對照組在CG甲基化的CpG位點和DMRs上存在明顯分離。與對照組相比，地西他濱干預(yù)組巨核細胞和MKPs中TSS區(qū)域及CG島的CG位點呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。在基因表達層面，地西他濱干預(yù)組巨核細胞中23,529個基因啟動子區(qū)域發(fā)生低甲基化，其中2136個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，476個基因下調(diào)；480個基因啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化，42個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，23個基因下調(diào)。

圖2：經(jīng)地西他濱干預(yù)后的全基因組DNA去甲基化和轉(zhuǎn)錄組變化。

（A）經(jīng)地西他濱干預(yù)的小鼠血小板和多倍體巨核細胞（≥8N）數(shù)量增加（上、中），而MKPs無差異（下）。

（B）地西他濱存在下培養(yǎng)Meg01細胞，與DMSO相比，經(jīng)地西他濱干預(yù)的細胞中CD41⁺細胞比例更高。

（C）每個樣本的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率（上）。地西他濱和DMSO組的巨核細胞（中）和MKPs（下）的mCG、mCH、hmCG和hmCH的修飾率。

（D）mCG修飾譜的主成分分析（紅色，地西他濱組；藍色，對照組。從上到下，巨核細胞-CpG，巨核細胞-DMRs，MKPs-CpG，MKP-DMRs）。

（E）差異甲基化胞嘧啶（DMC）甲基化差異與差異表達基因的組合圖（左），低甲基化或高甲基化且上調(diào)或下調(diào)的基因（右）。

 

（3）DNMT3A負向調(diào)控巨核細胞生成

在巨核細胞系中，地西他濱干預(yù)后DNMT3A和DNMT1蛋白表達水平降低。體外實驗中，DNMT3A敲低促進CD34⁺細胞向巨核細胞分化，而DNMT3A過表達則抑制巨核細胞生成，這一結(jié)果在Meg01細胞系中也得到驗證。免疫熒光染色和CFU-MK實驗進一步證實了DNMT3A對巨核細胞生成的負向調(diào)控作用。在體內(nèi)實驗中，移植過表達DNMT3A的HSCs小鼠出現(xiàn)血小板恢復(fù)延遲，而低劑量地西他濱干預(yù)可改善這一狀況。

圖3：DNMT3A負向調(diào)控巨核細胞生成。

（A）通過Western blot檢測地西他濱干預(yù)后巨核細胞系中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達。

（B-C）在巨核細胞系誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，DNMT3A的敲低和過表達分別促進和抑制巨核細胞生成。

（D）驗證過表達和敲低細胞中DNMT3A的表達。

（E） 使用Meg01細胞進行DNMT3A敲低和過表達設(shè)置。

（F）對源自DNMT3A敲低和過表達的CD34+細胞的巨核細胞進行免疫熒光染色。

（G） CFU-MK實驗表明DNMT3A過表達損害巨核細胞克隆。

 

（4）DNMT3A在巨核細胞生成過程中直接結(jié)合并甲基化ETS1和RUNX1

通過分析GEO數(shù)據(jù)庫和DNMT3A ChIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ETS1、RUNX1和KLF3是DNMT3A直接結(jié)合并甲基化的靶基因，且這些基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生相應(yīng)變化。在DPR患者骨髓中，ETS1和RUNX1表達降低，而KLF3水平無差異，提示ETS1和RUNX1可能參與DPR狀態(tài)下巨核細胞生成的異常調(diào)控。

圖4：在巨核細胞生成過程中，ETS1和RUNX1被DNMT3A直接結(jié)合并甲基化。

（A）在移植了對照組和過表達DNMT3A的HSCs受體小鼠的骨髓細胞中檢測DNMT3A表達。

（B）在HSC移植后每3天監(jiān)測血小板計數(shù)。

（C）從移植了對照組和過表達DNMT3A的HSCs以及接受地西他濱干預(yù)的受體小鼠中收集骨髓細胞。通過流式細胞術(shù)檢測MKs和MKPs水平。

（D）DNMT3A ChIP-seq顯示ETS1、RUNX1和KLF3被DNMT3A直接結(jié)合。

（E）與GGF患者相比，DPR患者CD34⁺CD41⁺細胞中ETS1和RUNX1表達降低，KLF3水平無差異。

 

討論

本研究通過WGBS深入探討了DPR患者中HSCs和MKPs的DNA甲基化特征，發(fā)現(xiàn)異常的高甲基化模式與巨核細胞生成受損密切相關(guān)，為理解DPR的發(fā)病機制提供了新的表觀遺傳學(xué)視角。

地西他濱作為一種低甲基化藥物，能夠有效促進巨核細胞的增殖和分化，其作用機制可能涉及對巨核細胞特異性基因啟動子區(qū)域的去甲基化，從而調(diào)控基因表達，這一發(fā)現(xiàn)為DPR治療提供了新策略。

研究揭示了DNMT3A在巨核細胞生成中的負向調(diào)控作用，并通過ChIP-seq技術(shù)驗證ETS1和RUNX1是DNMT3A的直接靶基因，進一步闡明DNMT3A介導(dǎo)的DNA甲基化在巨核細胞生成過程中的調(diào)控機制。

未來的研究可以擴大樣本量，深入探究多種表觀遺傳修飾之間的互作以及其在DPR發(fā)生發(fā)展中的協(xié)同調(diào)控作用。同時，結(jié)合臨床試驗進一步驗證低甲基化藥物在DPR治療中的安全性和有效性，為臨床治療提供更有力的證據(jù)支持。

參考文獻：

Tang Y, Song X, Zhang Z, Yao Y, Pan T, Qi J, Xia L, Wu D, Han Y. Hypermethylation of DNA impairs megakaryogenesis in delayed platelet recovery after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Sci Adv. 2025 May 9;11(19):eads3630. doi: 10.1126/sciadv.ads3630.