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近日，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院liang bugang、鄭懿民等為并列第一作者，沈英皓、柯愛武為共同通訊作者，在《Hepatology》雜志發(fā)表了題為“The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in HCC”的科研論文。該研究聚焦肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）中侖伐替尼（Lenvatinib）耐藥這一臨床難題，通過一系列實(shí)驗(yàn)探究了其耐藥機(jī)制。研究利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析，揭示了微管相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶樣蛋白（Microtubule-associated serine/threonine kinase-like, MASTL）在侖伐替尼耐藥的 HCC 細(xì)胞和組織中高表達(dá)，并通過染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-seq）等研究進(jìn)一步揭示應(yīng)激激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 24（Serine/threonine protein kinase 24, STK24）調(diào)控的 MASTL/YBX1/PAK4 軸在 HCC 中介導(dǎo)侖伐替尼耐藥和腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵作用，為突破HCC 侖伐替尼耐藥提供了潛在的治療靶點(diǎn)。易基因?yàn)楸狙芯刻峁┝?b>ChIP-seq技術(shù)服務(wù)，助力揭示MASTL信號(hào)軸在耐藥中的關(guān)鍵作用。

論文標(biāo)題：The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in HCC（應(yīng)激激活的STK24調(diào)控MASTL/YBX1/PAK4軸介導(dǎo)肝細(xì)胞癌侖伐替尼耐藥和腫瘤進(jìn)展）

發(fā)表時(shí)間：2025年6月2日

發(fā)表期刊：Hepatology

影響因子：IF15.8/Q1

技術(shù)平臺(tái)：轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、表觀基因組（ChIP-seq）等（易基因金牌技術(shù)）

作者單位：復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院

DOI：10.1097/HEP.0000000000001392

 

許多肝細(xì)胞癌（HCC）患者對(duì)侖伐替尼治療反應(yīng)不佳。因此，闡明耐藥的潛在機(jī)制并制定有效的逆轉(zhuǎn)策略至關(guān)重要。本研究首先對(duì)侖伐替尼耐藥的細(xì)胞系和患者來源樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析，確定MASTL是與HCC中侖伐替尼耐藥密切相關(guān)的關(guān)鍵因子。隨后，研究人員利用皮下注射小鼠模型、半數(shù)抑制濃度（IC50）實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)，揭示了MASTL在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和介導(dǎo)侖伐替尼耐藥的生物學(xué)功能。為進(jìn)一步闡明潛在機(jī)制，免疫共沉淀和質(zhì)譜分析揭示了MASTL促進(jìn)YBX1蛋白磷酸化。通過染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP-seq），研究進(jìn)一步驗(yàn)證磷酸化的YBX1在轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)PAK4激活，確定PAK4是MASTL通路的下游效應(yīng)分子。此外，質(zhì)譜分析和磷酸化分析表明，STK24可以在侖伐替尼作用下激活HCC中的MASTL。而阻斷MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸可恢復(fù)HCC對(duì)侖伐替尼的敏感性。

本研究結(jié)果表明，由應(yīng)激誘導(dǎo)的STK24激活MASTL/YBX1/PAK4軸在侖伐替尼耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過靶向MASTL抑制該軸可有效克服HCC中的侖伐替尼耐藥。

研究方法

l   細(xì)胞系構(gòu)建：建立侖伐替尼耐藥的 PLC/PRF/5-R（PLC-R）和 MHCC97H-R（97H-R）細(xì)胞系，為后續(xù)研究耐藥機(jī)制提供模型。

l   臨床樣本收集：從接受侖伐替尼治療的 HCC 患者中獲取穿刺活檢樣本，根據(jù)影像學(xué)評(píng)估的腫瘤反應(yīng)情況，將患者分為部分緩解（Partial response, PR）和耐藥（Progressive disease, PD）兩組，同時(shí)收集手術(shù)樣本及組織微陣列（Tissue microarrays, TMAs）。

l   轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析：對(duì)耐藥細(xì)胞系及其對(duì)照細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes, DEGs），通過火山圖、韋恩圖等分析工具，確定MASTL等關(guān)鍵基因在耐藥細(xì)胞中的異常表達(dá)情況，初步揭示耐藥相關(guān)的分子變化。

l   免疫共沉淀和質(zhì)譜分析：利用免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)合質(zhì)譜（MS）技術(shù)，鑒定與MASTL互作蛋白，進(jìn)一步通過截短突變體構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)，明確MASTL 與YBX1的互作位點(diǎn)，為深入研究MASTL功能及其在耐藥中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

l   染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）：通過 ChIP-seq 技術(shù)檢測(cè)磷酸化YBX1在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合 RNA-seq數(shù)據(jù)，鑒定出PAK4是YBX1的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄靶基因，揭示MASTL通過YBX1調(diào)控PAK4表達(dá)的分子機(jī)制，為解析MASTL信號(hào)軸在耐藥中的作用提供直接證據(jù)。

l   動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立裸鼠皮下移植瘤模型、原位肝癌模型以及患者來源異種移植瘤（PDX）模型，評(píng)估MASTL對(duì)HCC腫瘤生長(zhǎng)和侖伐替尼耐藥的作用，同時(shí)分析MASTL抑制劑MKI-1單獨(dú)或聯(lián)合侖伐替尼對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果，為臨床應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

 

結(jié)果圖形

（1）整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析揭示MASTL在侖伐替尼耐藥HCC細(xì)胞系和組織中高表達(dá)

研究者們首先通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析，比較分析了侖伐替尼耐藥細(xì)胞系（PLC-R和97H-R）與對(duì)照細(xì)胞系（PLC-C和97H-C）的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)差異。分析結(jié)果表明，在97H-R vs 97H-C細(xì)胞系、PLC-R vs PLC-C 細(xì)胞系以及臨床耐藥與敏感 HCC 組織樣本之間，均存在大量差異表達(dá)基因。通過火山圖篩選出符合特定條件（|log2FC|>1且p值<0.05）的DEGs，利用韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)在不同耐藥細(xì)胞系和組織樣本中均上調(diào)的基因，并鑒定出MASTL在多種癌癥中與治療耐藥相關(guān)，且在本研究的耐藥細(xì)胞系和組織樣本中表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步通過免疫組化（IHC）分析臨床HCC組織樣本，揭示MASTL高表達(dá)患者中侖伐替尼治療耐藥比例更高，表明MASTL與侖伐替尼耐藥密切相關(guān)。

圖1：整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析揭示MASTL在侖伐替尼耐藥的HCC細(xì)胞系和組織中高表達(dá)。

（A）不同濃度侖伐替尼耐藥細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系中侖伐替尼的IC50值。

（B）經(jīng)侖伐替尼處理的耐藥細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系的集落形成實(shí)驗(yàn)（n=6）。

（C）經(jīng)侖伐替尼處理后0、24、48、72和96小時(shí)，耐藥細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系的細(xì)胞活性。

（D）在接受侖伐替尼治療前被評(píng)估為疾病進(jìn)展（PD）或部分緩解（PR）的患者的MRI圖像。

（E）火山圖顯示在97H-R和97H-C細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定的DEGs。

（F）火山圖顯示在PLC-R和PLC-C細(xì)胞系以及組織樣本之間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定的DEGs。

（G）維恩圖顯示4個(gè)隊(duì)列之間上調(diào)的DEGs重疊分析。

（H）熱圖顯示維恩圖中的重疊基因。

（I）免疫印跡和qRT-PCR檢測(cè)在耐藥細(xì)胞系、對(duì)照細(xì)胞系以及正常肝細(xì)胞系L02中相對(duì)MASTL表達(dá)。

（J）免疫組化顯示在之前PR或PD的HCC組織樣本中相對(duì)MASTL表達(dá)。

（K）TMA3中MASTL的免疫組化染色（左）。通過MASTL表達(dá)分析病例比例（右）。

（2）MASTL過表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)

基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，揭示MASTL在多種癌癥類型（包括HCC）的腫瘤組織中表達(dá)高于正常組織。對(duì)HCC患者的預(yù)后分析表明，MASTL 高表達(dá)的患者總生存期（OS）更短，且在本研究收集的HCC樣本中，MASTL表達(dá)與惡性表型和不良預(yù)后相關(guān)。多變量邏輯回歸分析表明，MASTL過表達(dá)是 OS 和無病生存期（DFS）的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，強(qiáng)調(diào)MASTL作為HCC預(yù)后標(biāo)志物的潛力。

圖2：MASTL過表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)。

（A）與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的正常組織相比，不同癌癥類型中的MASTL表達(dá)水平。

（B）點(diǎn)圖顯示TCGA隊(duì)列中50個(gè)原發(fā)性HCC樣本和配對(duì)正常樣本中MASTL的表達(dá)。

（C）分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC樣本中MASTL的表達(dá)和患者的總生存期（OS）。

（D）qRT-PCR結(jié)果顯示5個(gè)HCC樣本和配對(duì)正常組織中MASTL的表達(dá)。

（E）通過點(diǎn)圖定量的免疫印跡檢測(cè)5個(gè)HCC和配對(duì)正常組織中MASTL的表達(dá)。

（F）TMA1和TMA2隊(duì)列中H&E染色和MASTL染色的代表性圖像。

（G）TMA1和TMA2隊(duì)列中以IOD值表示的MASTL表達(dá)。

（H-I）基于TMA1和TMA2隊(duì)列中MASTL表達(dá)的總生存期（OS）（H）和無病生存期（DFS）（I）曲線。

（J）區(qū)分HCC腫瘤和正常組織的AUROC值。

（K）熱圖顯示按MASTL表達(dá)分組的270例HCC患者的臨床病理特征。森林圖顯示通過單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析確定的各種表征對(duì)OS和DFS的作用。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

 

（3）MASTL促進(jìn)HCC細(xì)胞系對(duì)侖伐替尼耐藥及體內(nèi)外腫瘤進(jìn)展

在多種 HCC 細(xì)胞系中檢測(cè) MASTL 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在部分細(xì)胞系中表達(dá)較高。通過構(gòu)建 MASTL 過表達(dá)和敲低的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn) MASTL 表達(dá)變化直接影響 HCC 細(xì)胞對(duì)侖伐替尼的敏感性（圖 3C、D），且 MASTL 過表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移、侵襲和自我更新能力，而敲低則抑制這些過程。在體外實(shí)驗(yàn)中，MASTL 過表達(dá)的 HCC 細(xì)胞形成的克隆數(shù)量增多，耐藥性增強(qiáng)；而在體內(nèi)皮下移植瘤模型中，MASTL 敲低顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和侖伐替尼耐藥，過表達(dá)則相反（圖 3E-H）。此外，RNA 測(cè)序分析顯示 MASTL 過表達(dá)激活了 MAPK 信號(hào)通路（圖 3I、J），表明 MASTL 可能通過調(diào)節(jié)該通路促進(jìn) HCC 腫瘤進(jìn)展和耐藥。

圖3：MASTL促進(jìn)HCC細(xì)胞對(duì)侖伐替尼耐藥及體內(nèi)外進(jìn)展。

（A）免疫印跡（上圖）和qRT-PCR（下圖）結(jié)果展示不同HCC細(xì)胞系中相對(duì)的MASTL表達(dá)。

（B）免疫印跡和qRT-PCR結(jié)果展示MHCC97H細(xì)胞中MASTL過表達(dá)以及SNU449細(xì)胞中MASTL敲低的效率。

（C）MASTL過表達(dá)、MASTL敲低和對(duì)照細(xì)胞系中侖伐替尼的IC50值。

（D）MASTL過表達(dá)、MASTL敲低和對(duì)照細(xì)胞系用侖伐替尼處理的集落形成實(shí)驗(yàn)。

（E–H）使用指定細(xì)胞建立皮下腫瘤模型，小鼠接受侖伐替尼或安慰劑治療（n=6）。在指定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)腫瘤體積，終點(diǎn)時(shí)測(cè)量腫瘤重量。

（I）氣泡圖顯示MASTL過表達(dá)細(xì)胞系的KEGG通路分析結(jié)果。

（J）免疫印跡分析顯示指定細(xì)胞系中MAPK信號(hào)通路的激活。

（K）氣泡圖顯示MASTL過表達(dá)細(xì)胞系的GO：BP分析結(jié)果。

（L）差異雙向圖顯示GO：BP分析中“細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控”基因集里排名前10的上調(diào)和下調(diào)基因。